Prosedur pengujian bakteri escherchia coli dan coliform

Menurut SNI 01.2332.1-2006 prosedur kerja untuk penentuan bakteri Escherchia coli sebagai berikut:

1)  Persiapan Contoh

Timbang contoh padat sebanyak 25 gram atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan di uji, kemudian masukkan dalam wadah steril atau plastik stomacher steril dan tambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered, kemudian homogenkan selama 2 menit. Homogenat  ini  merupakan  larutan  dengan  pengenceran 10^-1.

2.  Tahap Analisa

a)  Uji pendugaan coliform (Presumptive Coliform)

(1)Siapkan pengenceran 10^-2 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10^-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer Butterfield’s Phosphate Buffered. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.

(2)       Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung lauryl tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham.

(3)       Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

(4)Lakukan “Uji penegasan coliform” untuk tabung-tabung positif.

b)        Uji Penegasan Coliform (Confirmed Coliform)

(1)       Inokulasikan tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ±1^oC. Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ±1^oC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

(2)       Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung BGLB yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g coliform”

c)  Uji pendugaan Escherichia Coli (Faecal Coliform, Presumptive Escherichia Coli)

(1)Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi EC Broth dalam waterbath sirkulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45^oC ± 0,5^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.

(2)   Periksa tabung-tabung EC Broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

(3)   Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g faecal coliform”.

d)  Uji Penegasan Escherichia coli (Confirmed Escherichia Coli)

(1)   Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke LEMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC + 1^oC.

(2)   Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.

(3)   Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escherichia coli dari masing-masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC+ 1^oC.

(4)   Jika koloni yang khas (typical) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring.

e)  Uji Morfologi

Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah di inkubasi selama 24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus. (SNI 01-2332.1-20065 dari 17).

f)   Uji Biokimia

(1)   Produksi Indol ( I )

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone Broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC +1^oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

(2)       Uji Voges Proskauer (VP)

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC+1^oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40   % KOH, kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby).

                   

(3)   Uji Methyl Red (MR)

Inkubasikan kembali MRVP Broth di atas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC+1^oC. Tambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning

(4)   Uji Sitrat (C)

Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35^oC + 1^oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

(5)       Produksi Gas dari Laktosa

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring kedalam LTB. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC+ 1^oC reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham

(6)   Interpretasi Hasil

Tabel 2. Interpretasi Hasil Pengujian Bakteri Escherchia Coli

              (SNI 01-2332.1-2006)

Kriteria	Biotipe 1	Biotipe 2
Gas pada tabung LTB	+	+
Indol	+	-
MR	+	+
VP	-	-
Citrat	-	-
Uji Morfologi	Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora	Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora